Os autores informam não haver conflito de interesse.

METHOD VALIDATION FOR QUANTIFICATION OF CARBAMAZEPINE AND VALPROIC ACID IN CAPILLARY BLOOD COLLECTED BY ONEDRAW

Isadora Ritter Müller (1)

http://lattes.cnpq.br/6809082662782758 – https://orcid.org/0000-0002-1489-9198

Lilian de Lima Feltraco Lizot (2)

http://lattes.cnpq.br/2523163224304535  – https://orcid.org/0000-0003-3165-1407

Rafael Linden (3)

http://lattes.cnpq.br/6036320391106370 – https://orcid.org/0000-0002-6966-5073

(1) Universidade Feevale, Laboratório de Toxicologia e Análises Toxicológicas, Novo Hamburgo-RS, Brasil. (autor principal)

(2) Universidade Feevale, Laboratório de Toxicologia e Análises Toxicológicas, Novo Hamburgo-RS, Brasil.(tratamento de dados)

(3) Universidade Feevale, Laboratório de Toxicologia e Análises Toxicológicas, Novo Hamburgo-RS, Brasil.(orientador)

Email: isa_muller@hotmail.com

RESUMO

Introdução: Indivíduos que realizam tratamento para epilepsia podem ter dificuldade em aderir ao tratamento. Dentre os motivos pode-se destacar o esquecimento e os efeitos adversos causados pela medicação. Com esse cenário, entende-se que existe uma necessidade de realizar o monitoramento terapêutico de pacientes em tratamento para epilepsia. O dispositivo OneDraw, que permite obter uma amostra de sangue capilar a partir de sua fixação na parte superior do braço, elimina alguns dos obstáculos encontrados na coleta de sangue capilar pelo dedo, como a dor, desconforto e tempo de espera. Material e método: Foi realizada a validação de um método em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas, seguindo os parâmetros de validação da Food and Drug Administration para a quantificação de carbamazepina (CBZ) e Ácido Valpróico (AV) em sangue capilar seco. Resultados: O método demonstrou alta sensibilidade para a detecção de CBZ e AV em amostras de sangue capilar. O limite de detecção do método foi de 1,0 mg L-1  para CBZ e 10 mg L-1 para AV. A precisão intra-ensaios foi de 3,29 a 6,75% para a CBZ e 4,67 a 6,54% para o AV. Discussão: Apesar de existirem outras técnicas, o uso da CLAE-EM/EM é a principal técnica usada para análise de anticonvulsivantes em DBS devido à sua alta sensibilidade e seletividade. Conclusão: Desta forma, um método simples e sensível está sendo validado para a quantificação CBZ e AV em amostras de sangue capilar coletadas com o dispositivo OneDraw.

Palavras-chave: Anticonvulsivantes, Sangue capilar seco, Cromatografia Líquida.

ABSTRACT

Introduction: Individuals undergoing treatment for epilepsy may have difficulty adhering to treatment. Among the reasons, forgetfulness and adverse effects caused by medication can be highlighted. With this scenario, it is understood that there is a need to carry out therapeutic monitoring of patients undergoing treatment for epilepsy. The OneDraw device, which allows you to obtain a capillary blood sample from its fixation in the upper part of the arm, eliminates some of the obstacles encountered in collecting capillary blood by the finger, such as pain, discomfort and waiting time. Material and methods: The validation of a method in High Performance Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry (HPLC-MS/MS) was carried out, following the validation parameters of the Food and Drug Administration for the quantification of carbamazepine (CBZ) and Valproic acid (AV) in dry blood spots. Result: The method demonstrated high sensitivity for the detection of CBZ and AV in capillary blood samples. The detection limit of the method was 1.0 mg L-1 for CBZ and 10 mg L-1 for AV. Intra-assay precision was 3.29 to 6.75% for CBZ and 4.67 to 6.54% for AV. Discussion: Although other techniques exist, the use of HPLC-MS/MS is the main technique used for the analysis of anticonvulsants in DBS due to its high sensitivity and selectivity. Conclusion: Therefore, a simple and sensitive method is being validated for CBZ and AV quantification in capillary blood samples collected with the OneDraw device.

Keywords: Anticonvulsivants, Dried Blood Spots, Liquid Cromatography.

1. INTRODUÇÃO

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) a epilepsia é uma doença crônica que afeta 50 milhões de pessoas no mundo de todas as idades, o que a torna a patologia neuronal mais comum em escala global (1).  A principal característica da epilepsia é a convulsão, a qual acontece de forma recorrente e imprevisível, e em função de um disparo descompensado de neurônios cerebrais (2).

No Brasil, estudos mostram que a prevalência de epilepsia na grande São Paulo é de 11,9 acometidos para cada 1000 indivíduos, enquanto em Porto Alegre é de 16,5 para cada 1000 habitantes (3). Estima-se que no Brasil 340 mil novos casos sejam diagnosticados por ano, havendo 1,8 milhão de pacientes com epilepsia ativa (4).  Além disso, um estudo realizado em Campinas e São José do Rio Preto (SP) demonstrou que a prevalência nas classes menos favorecidas foi de 7,5 para 1000 indivíduos e de 8,5/1000 em idosos. Também observou-se que cerca de 1/3 dos indivíduos estão em tratamento inadequado para a doença (5).

Para a maioria das pessoas com epilepsia, os medicamentos anticonvulsivantes são a principal modalidade de tratamento, com o objetivo de interromper as convulsões sem causar efeitos colaterais, que podem afetar a qualidade de vida. A remissão das convulsões também pode reduzir a morbidade e diminuir o risco de mortalidade prematura associada a convulsões contínuas (6).

Para aqueles que podem precisar de tratamento, um plano de manejo individualizado precisa ser implementado prontamente. O plano de manejo individualizado deve incorporar estratégias para prevenir o status epilepticus naqueles com convulsões repetidas ou prolongadas (7).

Os primeiros antiepiléticos utilizados nos anos 1990 foram a carbamazepina, fenitoína, fenobarbital, primidona e ácido valpróico, sendo os medicamentos para epilepsia de primeira geração. Apesar de novos fármacos já terem sido desenvolvidos apresentando vantagens em relação a tolerabilidade, os antiepiléticos de primeira geração continuam sendo prescritos. Isso acontece porque possuem eficácia e segurança bem estabelecida (8).

Existem três mecanismos de ação dos antiepiléticos de primeira geração, os quais consistem em (i) aumento da inibição do neurotransmissor. (ii) modulação dos canais de íon. (iii) inibição do glutamato, um neurotransmissor excitatório. A maioria dos antiepiléticos apresentam mais de um mecanismo (2,9).

A CBZ é em maior parte metabolizada no fígado, apenas 5% da droga é excretada sem alterações. Em humanos, a via mais importante para o metabolismo da CBZ é sua epoxidação pelas isoenzimas 3A4 e 3A5 do citocromo P450 (CYP) ao metabólito ativo carbamazepina-10,11-epóxido. Este metabólito tem propriedades antiepilépticas semelhantes e acredita-se que seja parcialmente responsável pela toxicidade do tratamento com CBZ. O risco para uma faixa subterapêutica de CBZ é aumentado de forma dose-dependente em ambos os regimes de duas e três vezes ao dia quando ocorreram atrasos ou esquecimento de doses (10).

Assim como a CBZ, o AV bloqueia os canais de sódio, limitando os disparos neuronais. Além disso, causa um aumento do GABA no cérebro, quando age nas enzimas responsáveis por inativar o GABA. Consequentemente, aumenta a ação do neurotransmissor. O AV apresenta uma característica importante em relação a sua farmacocinética, a qual não é linear. Essa particularidade é a responsável pelas diferentes concentrações que podem ser encontradas em diferentes indivíduos que muitas vezes tomam a mesma dose do medicamento (11,12).

Como consequência, a não aderência da terapia com antiepiléticos está associada com efeitos clínicos adversos e aumento das taxas de mortalidade por epilepsia. Pacientes que não aderem ao tratamento possuem riscos aumentados de apresentarem crises epiléticas contínuas. Por isso, o monitoramento terapêutico desses fármacos com doses individuais é de extrema importância para um tratamento eficaz. A principal matriz biológica empregada no monitoramento terapêutico da CBZ e do AV é a dosagem no plasma. No entanto, a saliva também tem sido utilizada, apresentando concentrações similares (12,13).

A utilização de dried blood spots (DBS, sangue seco) para monitoramento terapêutico de fármacos pode ser vantajosa devido a facilidade em relação a coleta e logística de transporte e armazenamento das amostras. A dosagem de antiepiléticos nessa matriz já foi realizada em outros estudos. Entre os aspectos específicos do DBS o hematócrito é utilizado como um fator de correção, isso porque dependendo do hematócrito do indivíduo, a mancha de sangue pode se espalhar menos ou mais no papel. A coleta é feita a partir de uma picada no dedo, e posteriormente, a gota de sangue deve ser posicionada em um papel absorvente, para formar uma macha seca (14).

A coleta com DBS tem como objetivo tornar o procedimento mais fácil, assim como o transporte das amostras. Durante o procedimento de coleta de DBS algumas das reclamações são o medo de perfurar o próprio dedo e o incomodo que a picada gera com o passar do dia. Por essa razão, dispositivos de autocoleta têm sido desenvolvidos para melhorar esses aspectos. O dispositivo OneDraw, que permite obter uma amostra de sangue capilar a partir de sua fixação na parte superior do braço, elimina alguns dos obstáculos encontrados na coleta de sangue capilar pelo dedo, como a dor, desconforto e tempo de espera. No entanto, ainda não foram realizados validação de métodos para quantificação de anticonvulsivantes em amostras de sangue capilar coletadas por este dispositivo.

O objetivo deste trabalho foi validar um método em CLAE-EM/EM para a quantificação de CBZ e AV em amostras de DBS coletadas com o dispositivo OneDraw. Esse dispositivo torna a coleta de amostras mais fácil, possibilitando que seja feita em outros locais além do laboratório, uma vez que o seu transporte também é facilitado. As etapas da validação foram realizadas conforme as recomendações de guias internacionais para métodos bioanalíticos (15).  

2. MATERIAL E MÉTODO

2.1. MATERIAIS, PADRÕES E REAGENTES

Os padrões analíticos de CBZ (1 mg mL-1) e AV (10 mg mL-1) foram adquiridas da Cerilliant (Round Rock, EUA), assim como as soluções de padrões internos deuterados CBZ-D10 (0,1 mg mL-1) e AV-D6 (1 mg mL-1). A acetonitrila foi adquirida da Honeywell (Seelzt, Alemanha) e o metanol da Merck (Darmstadt, Alemanha). O acetato de amônio e ácido fórmico foram da Sigma-Aldrich (Saint Louis, EUA). Água deionizada ultrapura foi fornecida por um sistema Milli-Q Reference da Millipore (Billerica, MA, EUA). O papel Whatman 903® foi obtido da GE Healthcare (Westborough, EUA).

2.2. PREPARO DE SOLUÇÕES, CALIBRADORES E CONTROLES DE QUALIDADE

Uma solução intermediária de ambos os analitos (6 mg mL^-1 AV e 0,6 mg mL^-1 CBZ) foi preparada a partir das soluções padrão por diluição com metanol. Uma solução intermediária separada dos compostos deuterados foi preparada da mesma maneira em concentrações de 20 µg ml^-1. Soluções de trabalho de CBZ, nas concentrações de 1,0; 2,5; 5; 10; 15 e 30 µg mL^-1, e de AV, nas concentrações de 10; 25; 50; 2000; 150; 300 µg mL^-1, foram preparados diluindo a solução intermediária com metanol. O solvente de extração DBS foi composto por uma mistura de metanol e acetonitrila (8:2, v/v) contendo CBZ-D10 e AV-D6, nas concentrações de 200 ng ml^-1. Os calibradores e controles de qualidade foram preparadas diluindo as soluções de trabalho dos fármacos com sangue branco, coletado em tubos contendo EDTA, na proporção de 1:20 (v/v).

2.3. EXTRAÇÃO DAS AMOSTRAS DE DBS

As amostras secas de DBS foram perfuradas (punção de diâmetro fixo de 6 mm) e transferidas para um tubo Eppendorf. Adicionou-se ao tubo uma alíquota de 200 µL do solvente de extração contendo os padrões internos seguido de incubação no ultrassom por 5 min, após, sob agitação a 1.000 rpm em vórtex por 30 min. O extrato foi centrifugado por 10 minutos, a 4º C e 10.000g. Uma alíquota de 1 µL de sobrenadante foi injetada no sistema CLAE-EM/EM.

2.4. CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS

A análise foi realizada em um sistema CLAE-EM/EM composto pelo cromatógrafo Acquity I-Class acoplado ao espectrômetro de massas triplo quadrupolo Xevo TQ-S Micro da marca Waters (Milford, Estados Unidos). A separação cromatográfica ocorreu em uma coluna Acquity UPLC® C8 (100 x 2,1 mm, 1,7 μm). As fases móveis foram acetato de amônio 2 mM (A) e acetonitrila contendo 0.01% de ácido fórmico (B). As análises foram realizadas no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM). Para cada composto, foram escolhidas duas transições MRM para quantificação e confirmação de CBZ e AV, após otimização por infusão das soluções de trabalho de cada analito (1 mg mL^-1 CBZ e 10 mg mL^-1 AV, em metanol).

2.5. SELETIVIDADE

Amostras de sangue capilar seco de seis voluntários não expostos a carbamazepina e ácido valpróico foram coletadas. A seletividade adequada foi caracterizada pela ausência de picos apresentando as transições monitoradas nos tempos de retenção dos analitos e padrões internos.

2.6. LINEARIDADE

Os calibradores foram preparados em 6 níveis (de 1.0 a 30 µg mL^-1 para CBZ e de 10 a 300 µg mL^-1 para AV) e analisados em quintuplicata. A curva de calibração foi desenvolvida relacionando a razão entre a área do pico da CBZ e do AV com a área dos picos de seus respectivos PIs com a concentração nominal de cada calibrador. Uma diferença de até 15% entre a concentração calculada e a concentração nominal foi considerada aceitável. A homocedasticidade dos dados foi avaliada pela realização do teste F com confiança de 95%. O modelo de ajuste ponderal mais adequado foi escolhido com base no menor somatório de erro relativo.

2.7. PRECISÃO E EXATIDÃO

CQB (1,5 µg mL^-1 para CBZ e 15 µg mL^-1para AV), CQM (7,5 µg mL^-1 para CBZ e 75 µg mL^-1 para AV) e CQA (22,5 µg mL^-1 para CBZ e 225 µg mL^-1 para AV) foram preparados e analisados em triplicata em 5 dias diferentes. Foi utilizada ANOVA de uma via para o cálculo da precisão intra e inter-ensaio, tendo um coeficiente de variação (CV%) máximo de 15% como critério para aceitação. A exatidão foi mensurada pela porcentagem da concentração nominal representada pela concentração calculada com a curva de calibração. Uma variação de ± 15% em relação ao valor nominal foi aceita.

2.8. SENSIBILIDADE

Amostras do menor ponto da curva de calibração (1.0 µg mL^-1 para CBZ e 10 µg mL^-1 para AV) foram preparadas em triplicata em 3 dias diferentes e analisadas juntamente com os ensaios de precisão e exatidão. Os critérios para aceitação do limite inferior de quantificação (LIQ) foram exatidão de 100 ± 20% do valor nominal e um CV% intra e inter-ensaio de no máximo 20%.

2.9. ESTABILIDADE NO AUTOAMOSTRADOR

A estabilidade dos extratos na amostra foi testada a partir de amostras de controles de qualidade alto e baixo, que foram mantidas no amostrador do cromatógrafo e injetadas em intervalos de uma hora por 12 horas.

3. RESULTADOS

A separação cromatográfica dos dois analitos e seus padrões internos foi realizada em uma corrida de 8,0 minutos empregando uma coluna Acquity C8 (100 x 2.1 mm; 1,7 µm). Os tempos de retenção foram de 3,7 e 3,64 minutos para carbamazepina e ácido valpróico, respectivamente.

O método foi validado tendo como base outros estudos com metodologias já validados para a análise de anticonvulsivantes em sangue capilar seco como de Linder (16). Os resultados parciais estão sumarizados na tabela 1.

A seletividade foi avaliada pelo processamento de seis amostras de DBS que não continham os analitos carbamazepina e ácido valpróico, com o intuito de avaliar a presença de picos cromatográficos interferentes na identificação e quantificação dos analitos avaliados neste método. Não foram encontrados picos cromatográficos dos dois analitos estudados em nenhuma das amostras.

A linearidade foi avaliada através do processamento da curva de calibração e dos controles de qualidade em cinco dias diferentes. As curvas de calibração foram ajustadas através de regressão linear, de acordo com a concentração de cada analito. Todas as curvas de calibração apresentaram valores de r superiores a 0,99, com todas concentrações retrocalculadas dos calibradores apresentando valores ±15% das concentrações nominais.

A precisão intraensaios foi de 3,29 a 4,77 % para CBZ e de 4,67 a 6,54 % para o AV. A precisão inter-ensaios foi de 3,87 a 5,78 % para CBZ e de 3,26 a 6,33 % para AV. A exatidão foi de 96,94 a 103,60 % para CBZ e de 97,19 a 102,42 % para AV. Desta forma, os valores de precisão e exatidão foram considerados aceitáveis para CBZ e AV.

O limite de quantificação foi avaliado através da análise de uma amostra de controle baixo, o ponto mais baixo da curva de calibração. A precisão intra-ensaios no nível do CQLIQ foi de 6,75 % para CBZ e 5,30 % para AV, e a precisão inter-ensaios foi de 5,42 % para CBZ e 3,33 % para AV. A exatidão neste mesmo nível de concentração foi de 96,13 e 96,71 % para CBZ e AV, respectivamente. Tanto a precisão como a exatidão apresentaram valores aceitáveis para a concentração de 1,0 e 10 µg mL^-1.

A estabilidade dos extratos na amostra foi testada a partir de amostras de controles de qualidade alto e baixo, que foram mantidas no amostrador do cromatógrafo e injetadas em intervalos de uma hora por 12 horas. As razões de áreas de CBZ apresentaram variação de -4,55 % para os controles baixos e -4,11 % para os controles altos quando comparadas com o tempo zero. Para o AV esta variação foi de -9,13 % para os controles baixos e de 7,89 % para os controles altos.

4. DISCUSSÃO

Foi apresentada uma técnica analítica, além do método de preparo da amostra. As concentrações de drogas em DBS são medidas por várias técnicas analíticas, como HPLC-UV (17), cromatografia gasosa com espectrometria de massa (GC-MS) (18), cromatografia líquida com espectrometria de massa (CL-EM) (19), e CL-EM/EM (20). No entanto, a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa é a principal técnica usada para análise de anticonvulsivantes em DBS devido à sua alta sensibilidade e seletividade.

A avaliação da seletividade demonstrou resultado satisfatório, uma vez que, não foram observados picos cromatográficos interferentes na identificação e quantificação dos analitos avaliados neste método. Além disso, o método se demonstrou linear, em que, todas as curvas de calibração apresentaram valores de r superiores a 0,99, com todas concentrações retrocalculadas dos calibradores apresentando valores ±15% das concentrações nominais.

O método se mostrou preciso e exato para a quantificação de CBZ e AV e seus respectivos PIs, como pode ser visto pelos resultados sumarizados na tabela 1, os quais não ultrapassaram a variação de ± 15% das concentrações nominais dos controles de qualidade analisados. Ainda, tanto a precisão como a exatidão apresentaram valores aceitáveis para a concentração de 1,0 µg mL^-1 da CBZ e 10.0 µg mL^-1 de AV, demonstrando a alta sensibilidade do método para a quantificações dos analitos. Considerando que a faixa terapêutica para pacientes que fazem o uso de CBZ é de 4 a 12 mg L^-1e de 50 a 100 mg L^-1 para AV (12), o método apresenta um grande potencial para baixas dosagem relacionadas a não aderência ao tratamento ou demonstrar a necessidade do ajuste da dose.

A estabilidade dos extratos na amostra foi testada a partir de amostras de controles de qualidade alto e baixo, que foram mantidas no amostrador do cromatógrafo e injetadas em intervalos de uma hora por 12 horas. Nesse período de análise, as variações encontradas quando comparadas a análise do tempo zero e a realizada em outros horários, não ultrapassou ±15%. Estes resultados indicam que é possível analisar grandes lotes de extratos sem impactos significativos na quantificação dos compostos.

Os parâmetros já analisados vêm demonstrando um método sensível, preciso e exato para a quantificação de CBZ e AV. No entanto, alguns parâmetros de grande importância para análise do DBS ainda estão sendo avaliados, como o efeito do Hct encontrado nessa matriz. As concentrações obtidas pela técnica DBS representam as concentrações do fármaco no sangue total. Os volumes do plasma e das células sanguíneas podem influenciar significativamente a concentração do fármaco no plasma e no sangue total. O Hct que é a porcentagem de volume das células sanguíneas no sangue varia entre a população e é normalmente de 0,41 a 0,51 em homens e 0,37 a 0,47 em mulheres (21). Essa grande variação dos valores de Hct o torna um dos elementos-chave para a interpretação adequada das concentrações de DBS.

O Efeito Matriz também ainda será analisado com o intuito de observar possíveis interferências causadas pela própria amostra na identificação e quantificação dos analitos que estão em estudo neste trabalho.

5. CONCLUSÃO

Um método simples, sensível e preciso está em desenvolvimento para a quantificação de CBZ e AV em amostras de DBS coletadas com o dispositivo OneDraw, utilizando a CLAE-EM/EM. Ainda é necessário a finalização da validação do método, para assim incluir todos os parâmetros necessários, além da realização de sua aplicação clínica para futuros artigos.

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