Projeto de pesquisa aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa da Universidade de Passo Fundo, sob o parecer número 5.444.275. Os autores informam não haver conflito de interesse.

METHOD VALIDATION FOR QUANTIFICATION OF CARBAMAZEPINE IN FINGERPRINTS DEPOSITED ON GLASS COVER SLIPS

Isadora Ritter Müller (1)

http://lattes.cnpq.br/6809082662782758 – https://orcid.org/0000-0002-1489-9198

Lilian de Lima Feltraco Lizot (2)

http://lattes.cnpq.br/2523163224304535  – https://orcid.org/0000-0003-3165-1407

Rafael Linden (3)

http://lattes.cnpq.br/6036320391106370 – https://orcid.org/0000-0002-6966-5073

(1) Universidade Feevale, Laboratório de Toxicologia e Análises Toxicológicas, Novo Hamburgo-RS, Brasil. (autor principal)

(2) Universidade Feevale, Laboratório de Toxicologia e Análises Toxicológicas, Novo Hamburgo-RS, Brasil.(tratamento de dados)

(3) Universidade Feevale, Laboratório de Toxicologia e Análises Toxicológicas, Novo Hamburgo-RS, Brasil.(orientador)

Email: isa_muller@hotmail.com

RESUMO

Introdução: Cerca de 38 milhões de pessoas são expostas à carbamazepina por ano para o tratamento de epilepsia. O fármaco se encontra na lista essencial da OMS. O tratamento para a epilepsia acontece de forma profilática, com o intuito de proporcionar ao paciente uma melhor condição de vida. Portanto, além da escolha do medicamento e da dose necessária para cada indivíduo, a adesão à terapia também tem grande importância no funcionamento do tratamento. A impressão digital é muito utilizada na área forense, essa matriz está aparecendo também na área toxicológica e clínica, para saber se o indivíduo fez a ingestão de alguma substância. Material e método: Foi realizada a validação de um método em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas, seguindo os parâmetros de validação da Food and Drug Administration para a quantificação de carbamazepina (CBZ) em impressões digitais. Resultados: O método demonstrou alta sensibilidade para a detecção de CBZ em amostras de impressões digitais. O limite de detecção do método foi de 0,05 ng digital^-1 para CBZ. A precisão intra-ensaios foi de 3,58 a 7,90%. A precisão inter-ensaios foi de 2,16 a 5,79% para CBZ. A exatidão apresentada pelo método foi de 95,02 a 102,76%. Discussão: As condições de cromatografia líquida desempenham um papel fundamental na obtenção de separação e ionização rápida e eficaz de componentes. Conclusão: Desta forma, um método simples e sensível está sendo validado para a quantificação de CBZ em amostras de impressões digitais depositadas em lâminas de vidro.

Palavras-chave: Carbamazepina, Impressões Digitais, Quantificação.

ABSTRACT

Introduction: About 38 million people are exposed to carbamazepine per year for the treatment of epilepsy. The drug is on the WHO essential list. The treatment for epilepsy happens in a prophylactic way, to provide the patient with a better life condition. Therefore, in addition to the choice of medication and the dose required for everyone, adherence to therapy is also of great importance in the functioning of the treatment. Fingerprint is widely used in the forensic area, this matrix is ​​also appearing in the toxicological and clinical area, to find out if the individual has ingested a substance. Material and method: A method was validated in High Performance Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry, following the validation parameters of the Food and Drug Administration for the quantification of carbamazepine (CBZ) in fingerprints. Results: The method demonstrated high sensitivity for detecting CBZ in fingerprint samples. The detection limit of the method was 0.05 ng digital^-1 for CBZ. The intra-assay precision ranged from 3.58 to 7.90%. The inter-assay precision was 2.16 to 5.79% for CBZ. The accuracy presented by the method ranged from 95.02 to 102.76%. Discussion: Liquid chromatography conditions play a key role in achieving fast and effective component separation and ionization. Conclusion: Thus, a simple and sensitive method is being validated for CBZ quantification in fingerprint samples deposited on glass slides.

Keywords: Carbamazepine, Fingerprints, Quantification.

1. INTRODUÇÃO

Cerca de 38 milhões de pessoas são expostas à carbamazepina por ano para o tratamento de epilepsia. O fármaco se encontra na lista essencial da OMS (1). A CBZ é em maior parte metabolizada no fígado, apenas 5% da droga é excretada sem alterações. Em humanos, a via mais importante para o metabolismo da CBZ é sua epoxidação pelas isoenzimas 3A4 e 3A5 do citocromo P450 (CYP) ao metabólito ativo carbamazepina-10,11-epóxido. Este metabólito tem propriedades antiepilépticas semelhantes e acredita-se que seja parcialmente responsável pela toxicidade do tratamento com CBZ. O risco para uma faixa subterapêutica de CBZ é aumentado de forma dose-dependente em ambos os regimes de duas e três vezes ao dia quando ocorreram atrasos ou esquecimento de doses (2).

O metabolismo da carbamazepina pela CYP3A4 é induzível e potencialmente inibido. Entre os antiepilépticos que podem inibir o metabolismo da carbamazepina e assim aumentar sua concentração sanguínea estão o clobazam e o estiripentol. Por outro lado, felbamato, oxcarbazepina, fenobarbital, fenitoína, primidona e rufinamida induzem o metabolismo da carbamazepina, diminuindo suas concetrações plasmáticas. Fármacos que não são utilizados no tratamento da epilepsia também podem afetar o metabolismo da carbamazepina, tais como a claritromicina, cirpofloxacino, eritromicina e fluoconazol, que inibem o metabolismo do fármaco. E entre as que induzem o metabolismo da carbamazepina, estão a erva de São João, efavirenz, teofilina e rifampicina (3).

Devido à autoindução, que geralmente começa após 3 a 5 dias após o início do tratamento e termina em 20 a 35 dias, sua depuração muda. Isso resulta em farmacocinética dependente do tempo com meia-vida de 25-65 h após uma dose única e 12-17 h no estado de equilíbrio pós-indução e uma diminuição progressiva em sua concentração sanguínea. O monitoramento terapêutico da droga (TDM) pode ser uma ferramenta útil para monitorar essas mudanças (4).

Para a maioria das pessoas com epilepsia, os medicamentos anticonvulsivantes são a principal modalidade de tratamento, com o objetivo de interromper as convulsões sem causar efeitos colaterais, que podem afetar a qualidade de vida. A remissão das convulsões também pode reduzir a morbidade e diminuir o risco de mortalidade prematura associada a convulsões contínuas (5).

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a epilepsia é uma doença crônica que afeta 50 milhões de pessoas no mundo de todas as idades, o que a torna a patologia neuronal mais comum em escala global (6).  A principal característica da epilepsia é a convulsão, a qual acontece de forma recorrente e imprevisível, e em função de um disparo descompensado de neurônios cerebrais (7).

No Brasil, estudos mostram que a prevalência de epilepsia na grande São Paulo é de 11,9 acometidos para cada 1000 indivíduos, enquanto em Porto Alegre é de 16,5 para cada 1000 habitantes (8). Estima-se que no Brasil 340 mil novos casos sejam diagnosticados por ano, havendo 1,8 milhão de pacientes com epilepsia ativa (9).  Além disso, um estudo realizado em Campinas e São José do Rio Preto (SP) demonstrou que a prevalência nas classes menos favorecidas foi de 7,5 para 1000 indivíduos e de 8,5/1000 em idosos. Também observou-se que cerca de 1/3 dos indivíduos estão em tratamento inadequado para a doença (10).

Para aqueles que podem precisar de tratamento, um plano de manejo individualizado precisa ser implementado prontamente. O plano de manejo individualizado deve incorporar estratégias para prevenir o status epilepticus naqueles com convulsões repetidas ou prolongadas (11).

O tratamento para a epilepsia acontece de forma profilática, com o intuito de proporcionar ao paciente uma melhor condição de vida. Como consequência, a não aderência da terapia com antiepiléticos está associada com efeitos clínicos adversos e aumento das taxas de mortalidade por epilepsia. Pacientes que não aderem ao tratamento possuem riscos aumentados de apresentarem crises epiléticas contínuas. Por isso, o monitoramento terapêutico desses fármacos com doses individuais é de extrema importância para um tratamento eficaz. A principal matriz biológica empregada no monitoramento terapêutico da CBZ é a dosagem no plasma. No entanto, a saliva também tem sido utilizada, apresentando concentrações similares (12,13).

Matrizes comuns como plasma e urina, já se sabe que são adequadas para a detecção de drogas. No entanto, matrizes alternativas, principalmente aquelas preocupadas com protocolos não invasivos, estão gerando um grande interesse, por causa da facilidade de coleta. O uso de impressões digitais como uma matriz biológica alternativa para a dosagem de drogas é uma área de pesquisa que está sendo desenvolvida, principalmente na toxicologia analítica (14).

A possibilidade de detecção de drogas em impressões digitais já foi descrita por Ismail et al (15), que utilizaram a matriz para detecção de cocaína e heroína. Também Du et al (16) determinaram e quantificaram fármacos hipolipemiantes em impressões digitais de pacientes (15,16). No entanto, apesar de já se saber da possibilidade de dosagem de drogas em impressões digitais, ainda não foram desenvolvidos métodos para quantificação de carbamazepina nessa matriz.

O objetivo deste trabalho foi validar um método em CLAE-EM/EM para a quantificação de CBZ em amostras de impressões digitais coletadas em lâminas de vidro. Esse formato torna a coleta de amostras mais fácil e menos invasiva, possibilitando que seja feita em outros locais além do laboratório, uma vez que o seu transporte também é facilitado. As etapas da validação foram realizadas conforme as recomendações de guias internacionais para métodos bioanalíticos (17).  

2. MATERIAL E MÉTODO

2.1. MATERIAIS, PADRÕES E REAGENTES

O padrão analítico de CBZ (1 mg mL^-1) foi adquirido da Cerilliant (Round Rock, EUA), assim como a solução de padrão interno deuterado CBZ-D10 (0,1 mg mL^-1). A acetonitrila foi adquirida da Honeywell (Seelzt, Alemanha) e o metanol da Merck (Darmstadt, Alemanha). O acetato de amônio e ácido fórmico foram da Sigma-Aldrich (Saint Louis, EUA). Água deionizada ultrapura foi fornecida por um sistema Milli-Q Reference da Millipore (Billerica, MA, EUA). As lâminas de vidro foram obtidas da FirstLab (Paraná, Brasil).

2.2. PREPARO DE SOLUÇÕES, CALIBRADORES E CONTROLES DE QUALIDADE

Uma solução intermediária do analito (30 µg mL^-1) foi preparada a partir das soluções padrão por diluição com metanol. Uma solução intermediária separada do composto deuterado foi preparada da mesma maneira em concentrações de 20 µg ml^-1. Soluções de trabalho de CBZ, nas concentrações de 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; e 10 ng digitais^-1, foram preparados diluindo a solução intermediária com metanol. O solvente de extração das digitais foi composto por uma mistura de metanol e acetonitrila (8:2, v/v) contendo CBZ-D10, na concentração de 200 ng ml^-1. Os calibradores e controles de qualidade foram preparadas a partir da aplicação de 10 µL das soluções de trabalho do analito em lâminas contendo digitais brancas, coletadas pressionando o polegar na lâmina.

2.3. EXTRAÇÃO DAS IMPRESSÕES DIGITAIS DAS LÂMINAS

Com a lâmina na posição horizontal foi pipetado 100 µL da solução de padrão interno da CBZ, o qual foi desprezado e aspirado em cima da digital cinco vezes. Posteriormente, a lâmina foi inclinada em um eppendorf de 5 mL e, com mais 100 µL de PI, a lâmina foi lavada e o todo o conteúdo desprezado no mesmo eppendorf. As amostras foram evaporadas a 45ºC por 20 minutos e retomadas com 200 µL da fase móvel A.

2.4. CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS

A análise foi realizada em um sistema de Cromatografia Líquida Acoplado a Espectometria de Massas (CLAE-EM/EM) composto pelo cromatógrafo Acquity I-Class acoplado ao espectrômetro de massas triplo quadrupolo Xevo TQ-S Micro da marca Waters (Milford, Estados Unidos). A separação cromatográfica ocorreu em uma coluna Acquity UPLC® C8 (100 x 2,1 mm, 1,7 μm). As fases móveis foram acetato de amônio 2 mM (A) e acetonitrila contendo 0.01% de ácido fórmico (B). As análises foram realizadas no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM). Para cada composto, foram escolhidas duas transições MRM para quantificação e confirmação de CBZ, após otimização por infusão das soluções de trabalho de cada analito (1 mg mL^-1 CBZ e 10 mg mL^-1 AV, em metanol).

2.5. SELETIVIDADE

Amostras de impressões digitais de seis voluntários não expostos a carbamazepina foram coletadas. A seletividade adequada foi caracterizada pela ausência de picos apresentando as transições monitoradas nos tempos de retenção dos analitos e padrões internos.

2.6. LINEARIDADE

Os calibradores foram preparados em 8 níveis (de 0,05 a 10 ng digitais^-1 e analisados em quintuplicata. A curva de calibração foi desenvolvida relacionando a razão entre a área do pico da CBZ com a área do pico de seu respectivos PI com a concentração nominal de cada calibrador. Uma diferença de até 15% entre a concentração calculada e a concentração nominal foi considerada aceitável. A homocedasticidade dos dados foi avaliada pela realização do teste F com confiança de 95%. O modelo de ajuste ponderal mais adequado foi escolhido com base no menor somatório de erro relativo.

2.7. PRECISÃO E EXATIDÃO

CQB (0,075 ng digitais^-1), CQM (0,75 ng digitais^-1) e CQA (7,5 ng digitais^-1) foram preparados e analisados em triplicata em 5 dias diferentes. Foi utilizada ANOVA de uma via para o cálculo da precisão intra e inter-ensaio, tendo um coeficiente de variação (CV%) máximo de 15% como critério para aceitação. A exatidão foi mensurada pela porcentagem da concentração nominal representada pela concentração calculada com a curva de calibração. Uma variação de ± 15% em relação ao valor nominal foi aceita.

2.8. SENSIBILIDADE

Amostras do menor ponto da curva de calibração (0,05 ng digitais^-1) foram preparadas em triplicata em 3 dias diferentes e analisadas juntamente com os ensaios de precisão e exatidão. Os critérios para aceitação do limite inferior de quantificação (LIQ) foram exatidão de 100 ± 20% do valor nominal e um CV% intra e inter-ensaio de no máximo 20%.

3. RESULTADOS

A separação cromatográfica do analito e seu padrão interno foi realizada em uma corrida de 8,0 minutos empregando uma coluna Acquity C8 (100 x 2.1 mm; 1,7 µm). O tempo de retenção foi de 3,7 minutos para carbamazepina.

O método foi validado tendo como base estudos com metodologias já validados para a análise de outras drogas em impressões digitais como de Ismail (15) e Goucher (18). Os resultados parciais estão sumarizados na tabela 1.

A seletividade foi avaliada pelo processamento de seis amostras de impressões digitais que não continham o analito da carbamazepina, com o intuito de avaliar a presença de picos cromatográficos interferentes na identificação e quantificação do analito avaliado neste método. Não foram encontrados picos cromatográficos do analito estudado em nenhuma das amostras.

A linearidade foi avaliada através do processamento da curva de calibração e dos controles de qualidade em cinco dias diferentes. As curvas de calibração foram ajustadas através de regressão linear, de acordo com a concentração de cada analito. Todas as curvas de calibração apresentaram valores de r superiores a 0,99, com todas concentrações retrocalculadas dos calibradores apresentando valores ±15% das concentrações nominais.

A precisão intra-ensaios foi de 3,58 a 7,90%. A precisão inter-ensaios foi de 2,16 a 5,79% para CBZ. A exatidão apresentada pelo método foi de 95,02 a 102,76% Desta forma, os valores de precisão e exatidão foram considerados aceitáveis para CBZ.

O limite de quantificação foi avaliado através da análise de uma amostra de controle baixo, o ponto mais baixo da curva de calibração. A precisão intra-ensaios no nível do CQLIQ foi de 2,16 % para CBZ, e a precisão inter-ensaios foi de 7,50 %. A exatidão neste mesmo nível de concentração foi de 99,11 para o analito. Tanto a precisão como a exatidão apresentaram valores aceitáveis para a concentração de 0,05 ng digital^-1.

A análise do efeito matriz demonstrou que a extração do analito foi suficiente para análise no presente método.

4. DISCUSSÃO

As condições de cromatografia líquida desempenham um papel fundamental na obtenção de separação e ionização rápida e eficaz de componentes. Neste trabalho foi apresentado uma técnica analítica para quantificação de CBZ em impressões digitais.

Para a dosagem de antiepilépticos, a análise por CL-MS/MS é considerada superior aos imunoensaios. Ainda, alguns métodos por cromatografia líquida conseguem quantificar múltiplas drogas, o que é benéfico para o paciente que faz tratamento com politerapia. A CBZ é comumente analisada por ionização positiva (19).

A avaliação da seletividade demonstrou resultado satisfatório, uma vez que, não foram observados picos cromatográficos interferentes na identificação e quantificação do analito avaliado neste método. Além disso, o método se demonstrou linear, em que, todas as curvas de calibração apresentaram valores de r superiores a 0,99, com todas concentrações retrocalculadas dos calibradores apresentando valores ±15% das concentrações nominais.

O método se mostrou preciso e exato para a quantificação de CBZ e seu respectivo PI, como pode ser visto pelos resultados sumarizados na tabela 1, os quais não ultrapassaram a variação de ± 15% das concentrações nominais dos controles de qualidade analisados. Ainda, tanto a precisão como a exatidão apresentaram valores aceitáveis para a concentração de 0,05 ng digital^-1 da CBZ, demonstrando a alta sensibilidade do método para a quantificações do analito.

Para o efeito matriz foram utilizadas impressões digitais de cinco voluntários, número maior que o já encontrado na literatura, quando a maioria dos trabalhos utiliza quatro os menos voluntários para este teste (15). Além disso, como manipulamos muitas substâncias e objetos com as mãos foi necessário de os voluntários lavassem as mãos antes de depositarem suas impressões digitais nas lâminas, esse procedimento também foi adotado em outros estudos de análise desta matriz (15,16). No efeito matriz foi observado uma variação de -2,97 a 2,99 para a concentração do CQA e de -5,20 a -1,50 para o CQB. Portanto, não foi observado significante efeito matriz que pudessem suprimir ou aumentar o sinal do composto quantificado no método.

Os parâmetros já analisados vêm demonstrando um método sensível, preciso e exato para a quantificação de CBZ. No entanto, alguns parâmetros de grande importância para a validação de um método ainda estão sendo realizados e analisados.

5. CONCLUSÃO

Um método simples, sensível e preciso está em desenvolvimento para a quantificação de CBZ em amostras de impressões digitais depositadas em lâminas de vidro utilizando a CLAE-EM/EM. Ainda é necessário a finalização de sua aplicação clínica para futuros artigos.

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