O autor informa não haver conflito de interesse.

VITREOUS HUMOR IN POST-MORTEM ETHANOL DETECTION: COLLECTION AND STORAGE RECOMMENDATIONS

Resumo

INTRODUÇÃO: O humor vítreo (HV) é uma matriz muito importante na detecção de etanol em investigações forenses post-mortem, devido à sua resistência à putrefação, menor risco de contaminação e facilidade de coleta, sendo uma alternativa valiosa quando sangue e/ou urina não estão disponíveis ou estão degradados. MATERIAL E MÉTODO: Com o objetivo de realizar uma revisão sistemática de literatura a fim de estabelecer recomendações para coleta e armazenamento do humor vítreo na pesquisa forense de etanol, foi realizada uma revisão sistemática utilizando as bases de dados Scopus, Web of Science e PubMed, nas buscas por artigos científicos originais, em inglês, publicados nos últimos dez anos e disponíveis na íntegra. RESULTADOS: Após triagem, 13 artigos foram selecionados para análise detalhada. Os estudos destacam que o HV, junto a biomarcadores como EtG e EtS, permite diferenciar o consumo de álcool antes da morte da produção pós-morte. Recomenda-se coleta por punção escleral, adição de fluoreto de sódio (1-2%) e armazenamento em recipientes herméticos a temperaturas inferiores a -20 °C. Para análise de compostos voláteis, a detecção deve ocorrer até 24 h após a coleta. DISCUSSÃO: O HV é menos suscetível a alterações pós-morte e, em casos de diabetes ou decomposição avançada, é a matriz preferencial para análise de EtG e EtS. Fatores como intervalo post-mortem, temperatura e condições ambientais influenciam os resultados, sendo essenciais para garantir a confiabilidade das análises. CONCLUSÃO: A coleta de HV deve ser rotina em exames forenses, pois permite avaliação precisa do consumo de etanol ante-mortem e da neoformação etílica, contribuindo para investigações mais seguras e reprodutíveis. Palavras-chave: Álcool, Biomarcadores, Necrópsia.

Palavras Chave: Álcool, Biomarcadores, Necrópsia.

Abstract

INTRODUCTION: Vitreous humor (VH) is a very important matrix in the detection of ethanol in post-mortem forensic investigations, due to its resistance to putrefaction, lower risk of contamination, and ease of collection, being a valuable alternative when blood and/or urine are unavailable or degraded. MATERIAL AND METHOD: To conduct a systematic literature review to establish recommendations for the collection and storage of vitreous humor in forensic ethanol research, a systematic review was carried out using the Scopus, Web of Science, and PubMed databases, searching for original scientific articles in English, published in the last ten years, and available in full. RESULTS: After screening, 13 articles were selected for detailed analysis. The studies highlight that VH, along with biomarkers such as EtG and EtS, allows differentiation between alcohol consumption before death and post-mortem production. Collecting the sample by scleral puncture, adding sodium fluoride (1-2%), and storing it in airtight containers at temperatures below -20°C. For volatile compound analysis, detection should occur within 24 hours of collection. DISCUSSION: HV is less susceptible to post-mortem changes and, in cases of diabetes or advanced decomposition, is the preferred matrix for EtG and EtS analysis. Factors such as post-mortem interval, temperature, and environmental conditions influence the results, being essential to ensure the reliability of the analyses. CONCLUSION: HV collection should be routine in forensic examinations, as it allows for accurate assessment of ante-mortem ethanol consumption and ethyl neoformation, contributing to safer and more reproducible investigations.

Keywords (MeSH): Alcohol, Biomarkers, Autopsy.

1. INTRODUÇÃO

Há várias décadas, o humor vítreo (HV) tem sido utilizado com sucesso em procedimentos médico-legais, tornando-se um material cada vez mais valioso na análise toxicológica. Isso se deve à localização anatômica do HV entre a lente e a retina, garantindo um bom isolamento do ambiente externo, e ao alto nível de hidratação (excedendo 98%), que é muito desejável em testes toxicológicos. Além da água, o HV contém uma rede de fibras de colágeno e hialuronato de glicosaminoglicano (1), dando-lhe uma consistência semelhante a um gel (2).

É uma fonte única de evidências físicas na perícia forense devido a sua localização, proteção relativa contra contaminação bacteriana, facilidade de amostragem e disponibilidade geral durante o exame post-mortem. Tem sido utilizado para definir aspectos como o momento da morte ou a presença de substâncias psicotrópicas no organismo (3). Seu caráter líquido resiste à putrefação, o torna um material bem atraente para análise qualitativa e quantitativa nos casos em que o sangue não está disponível ou deteriorado, uma vez que é menos afetado por essas mudanças e deve fornecer uma estimativa mais confiável das concentrações de etanol ante-mortem (4). Sua menor propensão à produção de etanol post-mortem do que o sangue, porque esse substrato, em um indivíduo saudável, não contém uma quantidade significativa de glicose, e o risco de contaminação por microrganismos é menor do que no sangue (5-8). O presente trabalho teve como objetivo realizar uma revisão sistemática de literatura a fim de estabelecer quais as recomendações para coleta e armazenamento do humor vítreo na pesquisa forense de etanol.

2. MATERIAL E MÉTODO

 

A condução desta revisão seguiu seis etapas distintas:

(1ª) identificação do tema e seleção da hipótese ou questão de pesquisa;

(2ª) estabelecimento de critérios para inclusão e exclusão de estudos;

(3ª) definição das informações a serem extraídas dos estudos selecionados;

(4ª) avaliação dos estudos incluídos na revisão;

(5ª) interpretação dos resultados;

(6ª) apresentação da revisão/síntese do conhecimento como descrito por Mendes; Silveira; Galvão (2008) (9).

Foram adotados como critérios de inclusão: artigos científicos originais que investigassem a temática de interesse, em língua inglesa, publicados nos últimos dez anos e gratuitamente disponíveis na íntegra. Excluíram-se estudos duplicados, anais de eventos, editoriais, cartas ao editor, monografias, dissertações, teses, capítulos de livros, diretrizes, artigos de revisão e meta-análises. Para encontrar os estudos recorreu-se às bases de dados Scopus, Web of Science e PubMed, usando os descritores extraídos dos Descritores em Ciências da Saúde (DeCS): vitreous humor, ethanol, detection, biomarkers, post-mortem.

3. RESULTADOS

Com auxílio do software online Rayyan® (Sistematic Review Management Plataform), foram identificados nas bases de dados 283 registros, dos quais, após exclusão das duplicadas, restaram 180 (Figura 1). Após análise dos títulos e resumos, foram excluídos aqueles que não se encaixavam no tema desta revisão, restando 37 trabalhos para análise do texto completo. Desses, 24 foram excluídos por texto completo indisponível; desenho errado do estudo; tipo errado de publicação; ou artigos fora do tema. A partir da análise detalhada dos 13 artigos restantes, foram coletados: objetivo do estudo, resultados principais, recomendações de coleta, armazenamento e possibilidades de biomarcadores (Tabela1).

Fig. 1: Fluxograma do processo de triagem e seleção dos registros

 

Artigos selecionados em definitivo	Achados e conclusões principais
Al-Asmari, Altowairgi, Amoudi, 2022 (10)	O intervalo post-mortem (IPM) e a temperatura desempenham papéis cruciais na produção de etanol pós-morte. Biomarcadores como EtG e EtS, são ferramentas confiáveis para identificar o consumo de álcool antes da morte, mesmo em casos de produção de etanol pós-morte devido à putrefação ou diabetes.
Maciejczyk et al., 2022 (11)	Avaliação do estresse oxidativo post-mortem tem utilidade diagnóstica limitada, devido às alterações irreversíveis causadas por processos pós-morte, como autólise e putrefação. A urina pode ser o material mais resistente a esses processos, e, portanto, o mais adequado para análises de biomarcadores redox.
Bujaroska et al., 2022 (12)	A Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização de Chama é um método versátil, podendo ser aplicado a diversos fluidos biológicos, garantindo maior confiabilidade nos resultados diante da estabilidade das amostras na presença de conservante e refrigeração ou congelamento. Assim como pela boa separação de interferentes, como acetona.
Thelander, Kugelberg, Jones, 2020 (13)	Espécimes alternativos podem ser usados para ajudar a interpretar a origem do etanol. Junto com marcadores como EtG e EtS, podem fornecer evidências de ingestão de etanol antes da morte. Contudo, os modelos de regressão linear para prever a concentração de etanol no sangue necessitam de cautela na interpretação dos resultados.
Dip, Mozayani, 2021 (14)	EtG/EtS são mais úteis para confirmar o consumo de álcool ante-mortem, independentemente dos níveis de etanol detectados, e do que para determinar a quantidade de álcool consumida. A presença de EtG e EtS é evidência de atividade metabólica e auxilia na identificação de consumo de etanol ante-mortem, mesmo em casos de decomposição ou diabetes.
Wang et al., 2021 (15)	Validação e desenvolvimento de um método LC-MS-MS simples, rápido e sensível para EtG e EtS em sangue humano e humor vítreo. O método mostrou-se confiável e útil na interpretação da origem do etanol em amostras post-mortem.
Savini et al., 2020 (16)	Alta Correlação entre Etanol no Sangue e no Humor Vítreo (HV): HV pode ser usado como uma matriz alternativa ao sangue em análises post-mortem, especialmente quando o sangue não está disponível ou está contaminado. Apresenta vantagens: menor contaminação por microrganismos, menor propensão à decomposição, facilidade de coleta, necessidade de pré-tratamento mais simples, poucas interferências no processo analítico e estabilidade do composto após a morte.
Neumann et al., 2020 (17)	Os resultados confirmam a importância do HV e do EtG em investigações forenses e sua relação à exposição recente ao etanol e à formação pós-morte. HV oferece uma maior taxa de detecção de EtG em comparação com o sangue e a urina, sendo menos suscetível à contaminação microbiológica.
Szeremeta et al., 2018 (18)	O HV como um material alternativo confiável para detectar a alcoolemia   em autópsias médico-legais, (quando não é possível coletar sangue venoso como em corpos putrefeitos, amostras de sangue altamente degradadas, exsanguinação e desidratação). Necessidade de coleta rotineira do HV. Fatores importantes: Condições Ambientais, Difusão de Álcool (envelhecimento), Tempo Decorrido entre a Morte e a Coleta das Amostras
Vezzoli, Bernini, De Ferrari, 2015 (19)	O estudo indica que o EtG no VH pode ser um bom marcador da ingestão de etanol ante-mortem (sendo um marcador de médio prazo) e formação post-mortem devido à putrefação. Isso é relevante tanto para investigações penais quanto para programas de reabilitação de pacientes alcoólicos.
Cowan et al., 2016 (20)	A combinação do Modelo Widmark com modificações e considerações qualitativas para a geração de álcool post-mortem permite uma interpretação mais abrangente do BAC obtido em investigações forenses. Permitindo melhor compreensão do estado de intoxicação de um indivíduo e BAC no momento da morte estimada de forma mais real.
Issa et al., 2016 (21)	Necessidade de um banco de dados estatístico preciso sobre mortes violentas relacionadas ao etanol para entender melhor o impacto do álcool no comportamento agressivo, saúde humana e mortalidade. importância de considerar fatores socioculturais e demográficos
Rainio et al., 2014 (22)	A CDT é menos sensível que o EtG para detectar o consumo de álcool antes da morte, mas pode ser útil em conjunto com outros biomarcadores. Ensaios de EtG têm custo analítico relativamente baixo (15–20 euros/amostra) quando comparados aos ensaios de BAC (35–40 euros/amostra).

Tab. 1: Artigos selecionados para compor a revisão e seus principais achados e conclusões.

4. DISCUSSÃO

É crescente o número de citações que apresentam como alternativa promissora a coleta rotineira do humor vítreo em autópsias médico-legais que visem a pesquisa etílica, em termos de etanol e de seus biomarcadores (15). No entanto, é importante destacar as condições que se apresentem apropriadas para determinação do etanol e de biomarcadores importantes no que diz respeito à coleta e ao armazenamento destas amostras a fim de que sejam promovidas maior segurança e reprodutibilidade destas análises. Dentre estas condições otimizadas descritas, as recomendações de coleta indicam que deve ser feita a punção escleral (canto lateral) de ambos os olhos (11; 13, 16; 18-22). Com adição de conservante fluoreto de sódio (NaF) de 1 a 2% (12; 16, 20).

Para maior vida útil das amostras, é recomendado que as amostras sejam armazenadas em recipientes hermeticamente fechados (20), em temperatura superior a -20 °C para o caso de armazenamento a longo prazo (12, 15, 19, 22). Contudo, para a detecção de voláteis (acetaldeído, 2-propanol, metanol) e álcoois superiores (n-propanol, 1-butanol, isobutanol) é recomendado que a detecção ocorra em até 24 h após a coleta/autópsia, mesmo em condições de congelamento (15).

Maciejczyk et al. (2022) (11) analisam os biomarcadores pela ótica do estresse oxidativo, portanto, interpretam a presença de acetaldeído em fluidos biológicos, como sangue, humor vítreo e LCR, como um metabólito tóxico diretamente relacionado à intoxicação por álcool. No contexto do estudo, sua presença foi qualitativamente confirmada nas amostras testadas, mas não foi associada a diferenças significativas nos biomarcadores de estresse oxidativo entre os grupos de estudo e controle. Isso pode ser explicado pelos processos pós-morte, como autólise e putrefação, que afetam os resultados (11).

Concentrações anormalmente altas de acetaldeído (> 0,14 mg/ml) em conjunto com etanol, n-propanol e 1-butanol são indicadores de putrefação/neoformação microbiana (18, 20). A putrefação pode levar à formação de etanol pós-morte devido à fermentação microbiana característica dos corpos em decomposição, onde bactérias e leveduras, como Candida glabrata, podem utilizar glicose disponível para produzir etanol, dificultando a distinção entre o álcool consumido antes da morte e o etanol produzido endogenamente após a morte (14). O n-propanol é considerado o álcool superior mais correlacionado à putrefação e à produção de etanol post-mortem (18).

O EtG é um metabólito direto do etanol e pode ser usado como biomarcador para monitorar o consumo de álcool nos dias recentes (17). Sua detecção em humor vítreo pode fornecer informações adicionais sobre o consumo de álcool antes da morte. O artigo de Neumann et al. (2020) (17) alega que EtG pode desaparecer em sangue altamente putrefeito, portanto, considera a dosagem de EtG em humor vítreo, mais indicada para casos de putrefação. O humor vítreo é menos suscetível a mudanças durante a decomposição, tornando-se um espécime valioso em investigações toxicológicas, especialmente em corpos em estado avançado de decomposição (17, 22). Contudo, EtS é mais estável mesmo em condições de putrefação severa. Dessa forma, Neumann et al. (2020) (17) consideram a dosagem de EtG em humor vítreo mais indicada para casos de putrefação.

Estudos genéticos também têm sido desenvolvidos em torno da temática de detecção de etanol. Szeremeta et al. (2018) (18) chamam a atenção para a possibilidade de o polimorfismo genético das enzimas responsáveis pela glucuronidação do etanol ser a responsável pelas diferenças interindividuais na síntese de EtG após o consumo de álcool. Projetando assim, testes desta natureza no ambiente forense relacionado à origem do etanol.

Destaque para situações especiais, como descrito nos estudos de Szeremeta et al. (2018) (18) e Dip, Mozayani (2021) (14), que apresentam o humor vítreo como a melhor matriz biológica para detecção de EtG e EtS em indivíduos diabéticos. Isso ocorre porque o humor vítreo é menos suscetível a alterações post-mortem, como a produção de etanol devido à putrefação ou glucosúria associada ao diabetes. Além disso, ele é uma alternativa viável quando amostras de sangue ou urina não estão disponíveis (como já comentado) e apresenta destaque em mortes que ocorreram ao ar livre, uma vez que nestas situações existe uma taxa mais alta de produção de etanol post-mortem (23, 24).

Em casos de diabetes, a glicose pode contribuir para a fermentação e aumentar as concentrações de etanol, contudo, EtG e EtS não são formados espontaneamente em condições de hiperglicemia pós-morte, portanto, a presença desses biomarcadores é evidência de atividade metabólica e pode ajudar a confirmar o consumo de etanol ante-mortem, mesmo em casos de diabetes (14).

Diabéticos podem apresentar maior produção de etanol pós-morte. Al-Asmari, Altowairgi, Amoudi (2022) (10) colocam o humor vítreo como a melhor matriz para análise em diabéticos, em comparação com a urina, por ser mais protegida de possíveis contaminações e por não sofrer tanto a influência de fatores como a ingestão de grandes quantidades de água (que pode diminuir significativamente os níveis de EtG na urina), uso de medicamentos que aumentam o fluxo urinário e glucosúria. Contudo, todos os espécimes de fluidos corporais analisados estão suscetíveis à neoformação de etanol, incluindo o humor vítreo. O que coloca o intervalo post-mortem e a temperatura como variáveis fundamentais.

O trabalho de Szeremeta et al. (2018) (18) chama atenção para como condições ambientais podem afetar a hidratação do sangue em corpos putrefeitos ou parcialmente carbonizados, o que pode alterar a concentração de álcool; em casos de afogamento, a difusão de álcool do humor vítreo para a água circundante pode impedir a determinação precisa do nível de álcool no momento da morte; o tempo decorrido entre a morte e a coleta das amostras pode afetar a concentração de álcool, embora o estudo não tenha encontrado diferença  significativa na concentração de etanol entre o sangue e o humor vítreo).

5. CONCLUSÃO

A coleta de humor vítreo não é indicada apenas em casos em que o sangue e/ou a urina não estejam disponíveis, devendo ser incluída na rotina forense, sendo uma amostra passível da determinação do álcool etílico e de marcadores importantes na correlação entre consumo ante-mortem e neoformação etílica.

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