1. INTRODUÇÃO

A ciência forense constitui uma atividade de cunho investigativo que busca aplicar princípios científicos na detecção, reconhecimento, exame e interpretação de vestígios, com o intuito de elucidar eventos de interesse público, como crimes diversos (1).

À luz desse cenário, a biologia molecular destaca-se como uma aliada crucial ao empregar métodos que viabilizam a análise meticulosa de vestígios biológicos comumente encontrados em cenas de crime, contribuindo para a condenação de culpados e absolvição de inocentes (2, 3). As técnicas moleculares dedicam-se, em grande parte, à análise do ácido desoxirribonucleico (DNA) para a identificação de suspeitos e vítimas, além de se estender para a esfera civil, abrangendo testes de paternidade, estudo de vínculos genéticos e pesquisa de doenças mutacionais (4, 5, 6). No entanto, dentro do arcabouço criminal, é também de suma importância a avaliação de vestígios que forneçam informações acerca da natureza e da sequência de eventos do delito (7).

Nesse sentido, a identificação de fluidos biológicos oriundos de cenas de crime (como sangue venoso, sangue menstrual, sêmen, secreção vaginal e saliva) tem sido um fator de destaque na ciência forense moderna à medida que estabelece uma conexão entre o suspeito, a vítima e o local, bem como auxilia na confirmação ou refutação de declarações prestadas por vítimas, suspeitos e testemunhas (7, 8). Desse modo, tal análise revela-se imprescindível para sustentar conclusões periciais e fornecer material probatório que norteará a decisão judicial (9, 10, 11).

Todavia, a caracterização de líquidos corporais ainda enfrenta limitações significativas, visto que muitas vezes encontram-se ocultos à percepção visual, dispersos em quantidades ínfimas ou em estado avançado de degradação. Somado a isso, metodologias convencionais permanecem aquém do ideal em termos de sensibilidade e especificidade, comprometendo, por vezes, a confiabilidade dos resultados (12).

Diante desse cenário, a epigenética forense emerge como uma potencial ferramenta mediante a utilização de microRNAs (miRNAs) para tal abordagem. Os miRNAs são uma classe de RNAs não-codificantes (ncRNA) que desempenham um papel essencial na regulação da expressão gênica. No âmbito forense, os miRNAs têm despertado um interesse notável para a identificação de fluidos e tecidos biológicos em vestígios criminais devido à alta especificidade tecidual, resistência à degradação e estabilidade em condições ambientais adversas (13).

Assim sendo, o objetivo desta pesquisa é analisar e discutir evidências recentes acerca do uso de miRNAs com aplicação na identificação forense de fluidos corpóreos, visando impulsionar o conhecimento científico na área da ciência criminal.

2. MATERIAL E MÉTODO

2.1 ESTRATÉGIA DE BUSCA

O presente trabalho realizou uma revisão sistemática da literatura, abrangendo o período de 2018 a 2025 (incluindo estudos publicados eletronicamente nesse período). A busca de artigos científicos foi realizada na base de dados PubMed, com a utilização dos descritores “microRNA”, “body fluid identification” e “forensic”, combinados pelo operador booleano “AND”. Adicionalmente, todo o processo metodológico foi pautado nas diretrizes do Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA).

2.2 TRIAGEM E SELEÇÃO DE ESTUDOS

A pesquisa foi elaborada com base em critérios de inclusão e exclusão previamente estabelecidos, com o objetivo de assegurar a relevância e a qualidade metodológica dos estudos científicos analisados. Sob essa perspectiva, o presente trabalho incluiu artigos que buscassem apresentar e descrever dados acerca da expressão diferencial de miRNAs em fluidos biológicos distintos para sua identificação no contexto forense, disponíveis na língua portuguesa ou inglesa, e que apresentassem uma abordagem experimental. Os critérios de exclusão foram os seguintes: a utilização de amostras de origem animal, a não abordagem exclusiva dos miRNAs como marcadores e a análise dos valores de proporção entre miRNAs ao invés dos níveis de expressão. Cabe salientar que o processo de triagem foi conduzido em duas etapas: inicialmente, realizou-se a leitura dos títulos e resumos dos artigos encontrados na base de dados, com o intuito de identificar os estudos potencialmente relevantes; em seguida, os artigos selecionados foram avaliados por meio da leitura do texto na íntegra, a fim de verificar se atendiam, de fato, aos critérios definidos.

3. RESULTADOS

A busca sistemática resultou em um total de 12 artigos considerados elegíveis para inclusão no presente estudo, os quais são apresentados na tabela abaixo.

Tabela 1 – Resultados dos artigos incluídos na revisão sistemática

 Fonte: Autoria própria (2026).

4. DISCUSSÃO

Diversas pesquisas vêm sendo conduzidas com o objetivo de determinar e validar miRNAs específicos, consolidando-os como ferramentas valiosas na identificação forense de amostras biológicas (12).

O primeiro estudo sobre a aplicação de miRNAs na identificação de líquidos corporais foi conduzido em 2009 por Hanson et al. Os autores examinaram 452 miRNAs em cinco fluidos forenses relevantes (sêmen, sangue venoso, saliva, sangue menstrual e secreção vaginal) pelo método de RT-qPCR. Foi identificado um painel composto por 9 miRNAs diferencialmente expressos com alto grau de especificidade em cada fluido. Em particular, miR-451a e miR-16 foram mais elevados no sangue venoso; miR-412 e miR-451a foram identificados no sangue menstrual; miR-135b e miR-10b no sêmen; miR-205 e miR-658 na saliva, enquanto miR-124a e miR-372 foram evidenciados em secreções vaginais (26). Um ano depois, Zubakov et al. investigaram um conjunto de 718 miRNAs em cinco fluidos corporais — sêmen, sangue venoso, saliva, sangue menstrual e secreção vaginal. Dois miRNAs para sangue venoso (miR-144 e miR-185) e dois para sêmen (miR-135a e miR-891a) foram confirmados como diferencialmente expressos por RT-qPCR, sugerindo sua utilidade para a identificação de ambos os fluidos (27).

Os vestígios biológicos encontrados em cenas de crime são de natureza diversa, e sua correta análise é imprescindível para o esclarecimento de atos infracionais. Líquidos corporais, como sangue, saliva, sêmen e secreções vaginais, embora compartilhem componentes similares, apresentam elementos específicos que viabilizam sua caracterização (28).

Diante desse cenário, o sangue é o vestígio mais frequentemente encontrado em locais de crime contra a vida, como homicídios, abortos, suicídios e crimes de lesão corporal. A saliva, por sua vez, é normalmente encontrada em crimes de natureza sexual, e pode ser detectada em marcas de mordida, cigarros, copos, talheres, cartas, envelopes, entre outros. De forma semelhante, o sêmen e a secreção vaginal são comumente encontrados associados a delitos envolvendo violência sexual, e podem estar presentes em superfícies diversas, como roupas, lençóis, estofados, entre outros (28, 29).

Concomitantemente, a distinção entre sangue venoso e sangue menstrual é de importância crucial na reconstituição do crime, seja ele relacionado a agressões físicas e/ou sexuais. A presença de sangue venoso está associada a agressões violentas que causam lesões ou morte, enquanto sangue menstrual pode estar envolvido em agressões sexuais durante o período menstrual (30).

O`Leary e Glynn realizaram a análise de amostras de sangue venoso, sangue menstrual, secreção vaginal, sêmen e saliva por meio da técnica de RT-qPCR. Observou-se que o miR-451 apresentou expressão consistentemente estável em todas as amostras de sangue venoso avaliadas, reforçando sua adequação como marcador molecular desse fluido. De forma análoga, o miR-412 demonstrou estabilidade expressiva em amostras de sangue menstrual, sugerindo sua aplicabilidade como indicador dessa secreção. No que se refere ao sêmen, a expressão do miR-891 revelou-se significativamente aumentada, evidenciando seu potencial como marcador diferencial para fluido seminal. Por sua vez, o miR-205 mostrou-se insuficiente para discriminar saliva e secreção vaginal. De modo semelhante, o miR-124a permitiu a diferenciação entre secreção vaginal e saliva, porém não foi capaz de distinguir com precisão entre secreção vaginal e sêmen. Ademais, os autores enfatizaram a relevância da utilização de um painel composto por múltiplos miRNAs, com o intuito de maximizar a robustez analítica e a confiabilidade dos resultados obtidos (16).

Paralelamente, o estudo conduzido por Liu et al. teve como objetivo avaliar os níveis de expressão de miRNAs em diferentes líquidos corporais. Os resultados indicaram que o miR-451a apresentou níveis significativamente maiores em amostras de sangue periférico e sangue menstrual. Por sua vez, o miR-203a-3p e o miR-205-5p demonstraram alta expressão em sangue menstrual, saliva, sêmen e fluido vaginal, os quais estão relacionados a células epiteliais. As expressões de miR-888-5p e miR-891a-5p foram preponderantes nas amostras de sêmen, enquanto o miR-124-3p apresentou maior nível de expressão em fluido vaginal. Os autores também ressaltaram que, de acordo com dados previamente estabelecidos na literatura, o miR-451a é comumente superexpresso em hemácias maduras; miR-205-5p e miR-203a-3p são marcadores característicos de células epiteliais; miR-888-5p e miR-891a-5p são associados ao sêmen; miR-144-3p e miR-144-5p são referenciados como altamente expressos em sangue menstrual; miR-214, em tecido cervical; e miR-654-5p e miR-124-3p, em fluido vaginal. Contudo, alguns resultados divergiram dos dados relatados. Os miRNAs miR-144-3p e miR-144-5p apresentaram expressão elevada tanto em sangue periférico quanto em sangue menstrual. O miR-214-3p, por sua vez, mostrou-se notavelmente expresso em sangue menstrual, saliva, sêmen e secreção vaginal, com um perfil semelhante ao observado para miR-203a-3p e miR-205-5p. Em contraste, a expressão diferencial do miR-654-5p não apresentou significância para distinção entre os cinco fluidos avaliados. Somado a isso, observou-se uma dificuldade na distinção entre saliva e fluido vaginal com os miRNAs utilizados, o que salienta a necessidade de identificação de novos marcadores específicos para essas secreções (20).

Concomitantemente, Li et al. conduziram uma análise de fluidos corporais  (sangue periférico, sangue menstrual, sêmen, saliva e secreção vaginal) por RT-qPCR com o objetivo de avaliar os perfis de expressão de miRNAs. Os autores identificaram que os miRNAs miR-451a, miR-16-5p, miR-144-3p, miR-185-5p, miR-126-3p, miR-486-5p e miR-144-5p apresentaram níveis de expressão significativamente elevados e distinguíveis em amostras de sangue periférico e sangue menstrual em comparação com os demais fluidos não sanguíneos. Por outro lado, miR-20a-3p, miR-106a-5p, miR-150-5p e miR-182-5p, propostos como indicativos de sangue periférico, não apresentaram a especificidade esperada, havendo sobreposição com outros fluidos. Dentre os marcadores candidatos à identificação específica de sangue menstrual, o miR-214-3p demonstrou capacidade de discriminar entre este e o sangue periférico, embora tenha exibido sobreposição com saliva, sêmen e secreção vaginal. Por sua vez,  miR-142-3p exibiu abundância semelhante em todos os quatro fluidos corporais, com exceção do sêmen. Os miRNAs miR-205-5p e miR-203a-5p apresentaram expressão aumentada em saliva e secreção vaginal em relação aos demais fluidos, contudo, não foram eficazes na diferenciação entre essas duas matrizes biológicas. Adicionalmente, o miR-223-3p apresentou níveis elevados de expressão em saliva, secreção vaginal e sangue menstrual, enquanto o miR-200c-3p mostrou expressão discretamente superior em sêmen e secreção vaginal quando comparado à saliva e ao sangue menstrual. Ressalta-se ainda que o miR-658 foi praticamente indetectável em todas as amostras analisadas. No que se refere aos marcadores candidatos à identificação de sêmen, destacam-se os miRNAs miR-10b-5p, miR-135a-5p, miR-891a-5p e miR-888-5p, que apresentaram perfis de expressão nitidamente diferenciados entre sêmen e os demais fluidos. Notadamente, miR-891a-5p e miR-888-5p foram ausentes ou expressos em níveis extremamente baixos nos fluidos não seminais, o que viabiliza sua utilização como marcadores altamente específicos para identificação positiva de sêmen. Embora os miRNAs miR-10a-5p e miR-135b-5p tenham apresentado expressão aumentada no sêmen, observou-se certa reatividade cruzada com outros fluidos corporais, o que limita sua especificidade. Em relação aos miRNAs candidatos para amostras de secreção vaginal, os marcadores miR-124-3p, miR-654-5p, miR-372-3p e miR-4286 foram ineficientes para distinguir este fluido dos demais (25).

No estudo de Li et al., 13 candidatos a miRNAs para os mesmos 5 fluidos corpóreos foram avaliados por RT-qPCR, onde todos puderam ser detectados, com exceção do  miR-133a-5p. Portanto, a análise final foi realizada com 12 marcadores. Corroborando com resultados anteriores, miR-891a-5p e miR-888-5p apresentaram uma superexpressão em amostras de sêmen. MiR-144-3p e miR-126-3p exibiram maior expressão em amostras de sangue (incluindo sangue periférico e sangue menstrual) em comparação com outros fluidos biológicos. O miR-144-3p apresentou melhor especificidade sanguínea do que o miR-126-3p. A expressão relativa do miR-497-5p e do miR-141-3p no sangue menstrual foi maior do que no sangue periférico, indicando que esses dois marcadores foram úteis para distinguir essas duas matrizes. Além disso, o miR-223-3p e o miR-1246 foram confirmados como específicos para saliva, mesmo contra secreção vaginal, enquanto a expressão do miR-378-3p não apresentou especificidade nos cinco fluidos. Ademais, os níveis de expressão do miR-203a-3p e do miR-205-5p foram significativamente maiores na saliva e na secreção vaginal, sendo consistente com resultados anteriores. Os níveis de expressão relativa do miR-1260b no sangue periférico e no sangue menstrual foram muito menores do que nos outros três fluidos corporais, o que indica que foi útil para distinguir entre amostras sanguíneas e não sanguíneas. Conforme os autores, nenhum miRNA específico para secreção vaginal foi encontrado durante o experimento. Os resultados confirmaram que uma combinação de vários miRNAs diferencialmente expressos é útil para a predição de líquidos corporais (21).

Fujimoto et al. analisaram amostras de sangue venoso, saliva, sêmen e secreção vaginal. O estudo abrangeu 15 marcadores candidatos, no entanto, miR-200c-3p, miR-658, miR-124-3p, miR-3685 e miR-205 não foram amplificados. Portanto, apenas os 10 marcadores restantes (miR-16-5p, miR-144-3p e miR-451a-5p para sangue venoso; miR-203a-3p e miR-223-3p para saliva; miR-10a-5p, miR-888-5p e miR-891a-5p para sêmen; miR-155-5p e miR-1260b para secreção vaginal) foram utilizados nas análises subsequentes. Os miRNAs miR-16-5p, miR-144-3p e miR-451a-5p foram mais expressos no sangue. Entretanto, miR-16-5p apresentou também elevada expressão nos demais fluidos, enquanto o miR-144-3p foi expresso apenas no sangue. O miR-451a-5p apresentou expressão significativamente superior nesse mesmo fluido quando comparado aos demais, se mostrando condizente com os resultados anteriores. No que tange aos biomarcadores candidatos à identificação de saliva, os miRNAs miR-203a-3p e miR-223-3p, apesar de serem mais expressos nesse fluido, apresentaram níveis semelhantes na secreção vaginal, o que dificultou sua distinção. Os miRNAs miR-10a-5p, miR-888-5p e miR-891a-5p evidenciaram expressão acentuada em amostras de sêmen. No entanto, ressalta-se que o miR-10a-5p também foi detectado em níveis semelhantes no sangue e na secreção vaginal, comprometendo sua especificidade. Em contrapartida, os miRNAs miR-888-5p e miR-891a-5p apresentaram baixa ou nenhuma expressão nos demais fluidos corporais, reforçando sua eficácia como marcadores específicos para identificação de sêmen. O miR-155-5p foi expresso no mesmo nível em todos os fluidos corporais, comprometendo sua capacidade de especificidade. O miR-1260b, apesar de ter demonstrado expressão acentuada no fluido vaginal, foi também expresso no sêmen e na saliva. Assim, sua utilização isolada para identificação dessa matriz biológica mostrou-se limitada, porém, quando combinado a outros marcadores como miR-203a-3p e miR-888-5p, sua eficácia discriminatória é substancialmente ampliada. O sangue venoso pôde ser eficientemente identificado por meio do miR-144-3p e miR-451a-5p, enquanto o sêmen foi claramente distinguível por meio do miR-888-5p e miR-891a-5p. Por outro lado, a saliva e a secreção vaginal não foram qualitativamente distinguíveis. Os autores destacam que ambos os fluidos contêm propriedades semelhantes, como células epiteliais e muco, o que pode justificar a similaridade nos perfis de expressão de miRNAs. Ainda assim, observou-se que miR-203a-3p e miR-223-3p foram mais intensamente expressos na saliva, enquanto miR-1260b apresentou maior expressão relativa na secreção vaginal quando comparado aos demais fluidos, sugerindo seu potencial uso em estratégias combinatórias de identificação (18).

A pesquisa conduzida por Altmeyer, Baumer e Hall abordou 18 miRNAs em amostras de sangue periférico, sangue menstrual, saliva, sêmen, secreção vaginal e pele utilizando a técnica de RT-qPCR. Vale ressaltar que as amostras foram depositadas em quantidades vestigiais, a fim de simular cenários forenses reais. Os autores validaram 8 candidatos a miRNAs (miR-144-3p, miR-451a, miR-205-5p, miR-214-3p, miR-888-5p, miR-891a-5p, miR-193b-3p e miR-1260b) com alta especificidade tecidual e 4 (miR-203a-3p, miR-141-3p, miR-200b-3p e miR-4286) com menor poder discriminatório, mas que ainda contribuíam para a diferenciação dos fluidos. Dos 18 candidatos, 2 selecionados para sangue menstrual (miR-3120-3p e miR-412-3p), 3 para secreção vaginal (miR-372-3p, miR-124-3p e miR-654-5p) e o marcador selecionado para pele (miR-3169) não apresentaram expressão diferencial significativa. Logo, tais miRNAs foram descartados para as análises seguintes. O conjunto de 12 miRNAs restantes distinguiu com sucesso todos os fluidos biológicos, incluindo a discriminação entre sangue periférico e sangue menstrual, bem como entre saliva e secreção vaginal — um desafio descrito em estudos anteriores. Diversos marcadores demonstraram alto grau de especificidade nos níveis de expressão: miR-888-5p e miR-891a-5p foram altamente expressos apenas no sêmen; miR-214-3p mostrou um nível mais alto no sangue menstrual, enquanto miR-193b-3p e miR-1260b foram altamente exibidos na secreção vaginal. O miR-144-3p e o miR-451a foram notavelmente expressos no sangue menstrual e no sangue periférico. Seu uso em combinação com o miR-214-3p, específico para sangue menstrual, pode permitir a discriminação entre ambos os tipos de amostras sanguíneas. Da mesma forma, miR-205-5p foi mais expresso na saliva, mas também na secreção vaginal. Portanto, em combinação com os dois miRNAs específicos para secreção vaginal (miR-193b-3p e miR-1260b), ele tem potencial para inferência de saliva. Por outro lado, alguns resultados foram considerados insatisfatórios. Nesse sentido, o miR-203a-3p, proposto como candidato para saliva, apresentou maior expressão na secreção vaginal, comprometendo sua especificidade. Os miRNAs miR-141-3p e miR-200b-3p, inicialmente selecionados como marcadores para sangue menstrual, demonstraram expressão considerável em múltiplos fluidos, perdendo valor discriminatório. Somado a isso, o miR-4286, candidato para secreção vaginal, também revelou baixa especificidade tecidual (23).

O trabalho de He et al. teve como intuito primordial a avaliação de miRNAs capazes de diferenciar sangue menstrual de sangue periférico, bem como fluidos sanguíneos de não sanguíneos (saliva, sêmen e fluido vaginal) através de RT-qPCR. Considerando que amostras de sangue constituem os vestígios biológicos mais frequentemente encontrados em cenas de crime, a distinção entre sangue periférico e menstrual é de suma importância na caracterização da natureza e da dinâmica do delito. O miR-451 foi substancialmente expresso tanto em sangue periférico quanto menstrual, apresentando ainda níveis significativamente inferiores nos fluidos não sanguíneos. A expressão de miR-205, miR-214 e miR-203 foi acentuadamente maior em sangue menstrual em comparação com sangue periférico. A partir dessa análise, os autores enfatizaram que tais miRNAs podem ser aplicados para a distinção adequada de ambos os tipos de amostras sanguíneas. O miR-451 é altamente e especificamente expresso em hemácias maduras; miR-203 e miR-205 são específicos de células epiteliais, enquanto miR-214 apresenta alta expressão no líquido cervical. Apesar do sangue periférico e menstrual apresentarem muitos glóbulos vermelhos, o sangue menstrual contém grandes quantidades de detritos endometriais, muco cervical e fluido vaginal. No estudo, o miR-451 foi usado para discriminar entre amostras sanguíneas de não sanguíneas e obteve 100% de precisão. De modo semelhante, a combinação de miR-203, miR-205 e miR-214 permitiu a diferenciação entre sangue menstrual e periférico, também com 100% de precisão (19).

Diferentemente das abordagens tradicionais descritas pelos demais autores, Mayes, Seashols-Williams e Hughes-Stamm introduziram um método de eletroforese capilar após a transcrição reversa dos miRNAs e sua amplificação. Assim sendo, foram investigados os seguintes marcadores: miR-451a e miR-142-3p para identificação de sangue periférico; miR-141-3p e miR-412-3p para sangue menstrual; miR-891a e miR-10b para sêmen; e miR-205 para saliva. Nas amostras de sangue periférico, os marcadores miR-451a e miR-142-3p foram consistentemente detectados em todos os perfis analisados, mas não foram específicos para essa matriz. O miR-205, por sua vez, foi detectado em todos os fluidos corporais analisados, com exceção do sangue venoso. Tal achado não é inesperado, pois o marcador foi associado a células epiteliais. Os miRNAs miR-451a, miR-141-3p e miR-205 foram observados em todas as amostras de sangue menstrual, enquanto miR-412-3p foi observado apenas em algumas amostras dessa matriz biológica, demonstrando baixa eficiência analítica. O miR-142-3p foi observado em todos os fluidos, exceto no sangue menstrual. Os marcadores miR-891a e miR-10b foram detectados em todas as amostras de sêmen. Nos perfis de saliva, miR-142-3p e miR-205 foram observados em todas as amostras, onde a presença exclusiva desses dois marcadores, combinada à ausência dos demais, sugere a identificação do fluido salivar (14).

Dørum et al., por outro lado, empregaram a metodologia de sequenciamento massivamente paralelo para a análise dos miRNAs, e a partir disso propuseram modelos que incluíam subconjuntos de miRNAs para identificar fluidos. Os autores avaliaram um modelo com 9 marcadores (miR-1246, miR-126-3p, miR-200a-3p, miR-203b-5p, miR-205-5p, miR-375, miR-451a, miR-486-3p e miR-486-5p), e a partir dessa abordagem, foram determinados os níveis de expressão para cada fluido/tecido incluído no experimento (sangue periférico, sêmen, saliva, fluido vaginal, sangue menstrual e pele). Conforme apresentado pelos autores, a presença do marcador miR-200a-3p aumenta a probabilidade de sangue menstrual. Simultaneamente, os coeficientes negativos para sangue periférico e secreção vaginal indicam que a presença desse marcador torna esses dois fluidos corporais menos prováveis. O marcador miR-203b-5p, e parcialmente miR-205-5p, distingue entre amostras de sêmen e secreção vaginal, sendo mais expressos neste último. O miR-451a, por sua vez, foi notoriamente mais expresso no sangue menstrual, e demonstrou utilidade na separação entre este e a secreção vaginal. O miR-375 apresentou maior nível no sêmen, mas também exibiu uma expressão notável no fluido vaginal. O miR-1246 foi expresso tanto na saliva quanto na pele, enquanto miR-126-3p, miR-486-3p e miR-486-5p não exibiram diferenças de expressão significativas. No estudo, foram relatadas dificuldades na distinção precisa entre amostras de saliva e pele utilizando o modelo proposto. Da mesma forma, os autores evidenciaram que pode ocorrer alguma sobreposição entre a secreção vaginal e as amostras de sangue menstrual. Há uma possível explicação biológica para tais reações cruzadas. Como a saliva, a secreção vaginal e o sangue menstrual se originam de membranas mucosas, pode-se esperar que compartilhem alguns padrões de expressão de miRNAs sobrepostos. Além disso, não deve ser descartada a possibilidade de contaminação das amostras com células epiteliais da pele durante o processo de coleta, o que poderia explicar a detecção inesperada de sinais moleculares atribuídos a tecidos cutâneos. Em consonância com os resultados dos demais autores discutidos anteriormente, os achados de Dørum et al. reforçam a necessidade do uso combinado de múltiplos miRNAs  para alcançar uma predição precisa e confiável da origem biológica de vestígios forenses (17).

Em contrapartida, o trabalho de Alsaeed e colaboradores teve ênfase na análise dos marcadores miR-20b e miR-197 para a diferenciação de fluidos encontrados em casos de agressão sexual, com foco em sêmen e fluido vaginal. Os níveis de expressão de miR-20b e miR-197 foram detectados pela técnica de RT-qPCR, e os resultados demonstraram expressão significativamente distinta desses miRNAs no sêmen em comparação com o fluido vaginal. Os níveis de miR-20b foram expressivamente mais elevados em amostras de sêmen e mais reduzidos em amostras de secreção vaginal. Seguindo a mesma tendência, a expressão de miR-197 apresentou maior valor no sêmen, e menor valor no fluido vaginal. Dessa forma, as análises demonstraram o potencial dos marcadores para a determinação adequada dos principais fluidos associados a crimes de cunho sexual (24).

De modo semelhante, o estudo de Tian et al. teve como foco primordial a identificação e validação de miRNAs capazes de diferenciar sêmen de outros fluidos, incluindo sangue venoso, sangue menstrual, saliva e secreção vaginal. Os marcadores candidatos para identificação de sêmen (miR-10a, miR-10b, miR-135a, miR-135b, miR-888 e miR-891a) foram avaliados pela técnica de RT-qPCR. Os autores observaram certa sobreposição nos níveis de expressão do miR-10a e do miR-10b entre o sêmen e o sangue menstrual. De forma análoga, o miR-135b apresentou padrões de expressão coincidentes entre sêmen, sangue menstrual, secreção vaginal e saliva, o que compromete sua especificidade. Por outro lado, miR-888 e miR-891 apresentaram expressão alta e estável no sêmen, sendo, portanto, recomendados pelos autores como biomarcadores específicos na identificação forense desse fluido, diferentemente dos marcadores miR-10a, miR-10b, miR-135a e miR-135b, que foram afetados por sobreposição de expressão e coexpressão com outras secreções (15).

Em uma abordagem distinta, Chen et al. buscaram principalmente validar o miR-223-3p para a identificação de saliva e sua distinção de fluido vaginal, visto que o desempenho dos métodos na diferenciação entre esses fluidos não tem sido satisfatório devido à similaridade da sua composição celular. Inicialmente, foi realizado um sequenciamento de alto rendimento a fim de rastrear perfis de miRNAs em cinco tipos de fluidos biológicos, incluindo sangue periférico, sangue menstrual, saliva, sêmen e secreção vaginal. Após a validação por RT-qPCR, os autores confirmaram que o miR-223-3p pode ser empregado como um marcador indicativo de fluido salivar. Embora o miR-340-5p tenha sido sugerido como um candidato promissor na etapa de sequenciamento para identificação de saliva, sua posterior validação por RT-qPCR revelou níveis de expressão baixos ou inexistentes nesse fluido, levando à sua exclusão como marcador confiável. Por conseguinte, os resultados inferem o potencial do miR-223-3p como marcador preciso para identificação de saliva. Ainda segundo Chen et al., não foi possível detectar miRNAs com especificidade suficiente para a caracterização de secreção vaginal (22).

Vale pontuar que algumas discrepâncias observadas entre diferentes estudos podem ser atribuídas às metodologias distintas de detecção e à escolha dos genes de referência usados como controle interno. A técnica de RT-qPCR, por exemplo, apresenta sensibilidade superior quando comparada a sequenciamentos de nova geração. Somado a isso, os genes de referência selecionados devem ser expressos de forma estável e constante no sistema experimental em estudo (13, 31).

É preciso destacar que as metodologias de análise de miRNAs empregadas pelos autores mencionados nesta revisão incluíram RT-qPCR, sequenciamento de nova geração e eletroforese capilar. Entretanto, a RT-qPCR consolidou-se como a técnica padrão-ouro para avaliar os níveis de expressão de miRNAs previamente selecionados e validá-los como potenciais biomarcadores para diferentes secreções biológicas. O baixo consumo de amostras, juntamente com a elevada sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade desse método o tornam consideravelmente vantajoso em cenários forenses, embora não permita a identificação de novos miRNAs (13,  32, 33, 34).

Em contraste, as análises de sequenciamento de nova geração representam uma abordagem mais abrangente para o estudo e pesquisa de miRNAs. A plataforma permite detectar simultaneamente centenas de miRNAs e, sobretudo, identificar novos marcadores. Apesar das limitações, como a demanda de uma infraestrutura laboratorial avançada, maior tempo de execução e custo elevado, o sequenciamento é crucial para análises exploratórias que buscam expandir o repertório de miRNAs candidatos para identificação de fluidos forenses (13, 30, 32, 33, 34).

A integração da eletroforese capilar ao fluxo analítico, apesar de ter sido abordada em um dos estudos, apresenta baixa relevância para esse tipo de análise atualmente.

 5. CONCLUSÃO

Portanto, embora os estudos estejam em fase inicial de expansão, evidencia-se que a aplicação forense de miRNAs voltada para a identificação de fluidos corpóreos configura uma área próspera, com capacidade para revolucionar a forma como os vestígios biológicos são abordados na investigação criminal. Desse modo, o uso desses biomarcadores pode superar as limitações apresentadas pelas metodologias atualmente empregadas, oferecendo maior precisão, especificidade e poder de discriminação. Ademais, tal cenário destaca a aplicabilidade da epigenética no âmbito criminal, sinalizando uma nova era para a ciência forense.

Nesse contexto, perspectivas futuras para esse campo incluem o estabelecimento de protocolos padronizados para a detecção e quantificação dos marcadores; a definição de genes de referência adequados para normalização; a criação de painéis específicos de miRNAs validados por meio de pesquisas interlaboratoriais; e a busca por miRNAs capazes de contornar os desafios na distinção entre fluidos biologicamente semelhantes, o que foi relatado como uma problemática por muitos autores. Adicionalmente, é imprescindível ampliar os estudos acerca de variações de expressão sob diferentes condições ambientais e biológicas, a fim de assegurar confiabilidade analítica mesmo em amostras complexas.

Por fim, a relevância do presente trabalho não se restringe apenas à abordagem do uso de miRNAs na caracterização da origem de fluidos, mas também reforça o papel da biologia molecular como um pilar fundamental na ciência forense. Em um cenário onde os vestígios são frequentemente mínimos e o tempo é um fator crítico, os resultados obtidos por técnicas de análise molecular se tornam decisivos para desvendar a verdade e representam a última voz da vítima de um crime.